Back to school: la storia dell’ Agar e dei substrati selettivi



estratto di carne liebig agar microbiologia

Una delle prime pubblicità per brodo di carne Liebig.

Le origini di terreni di coltura risalgono al 19 ° secolo, quando la scienza della microbiologia era solo all’inizio. L’azienda capostipite, la Liebig Extract of Meat Company ( Lemco ) è stata costituita nel 1865 e ha prodotto estratti di carne con il nome commerciale di Lab Lemco . Oltre ad essere un alimento popolare nato con il nome ‘ estratto di carne Leibig  ‘, divenuta in seguito Oxo, si impose subito sul mercato come terreno di coltura batterica. I primi approcci dei ricercatori si basavano sull’utilizzo dello stesso substrato su cui si trovava il batterio, come ad esempio nello studio del 1832 di Bartolomeo Bizio sulle ‘ macchie di sangue”  su ostie causate da Serratia marcescens , in cui venne utilizzato il pane inzuppato come substrato di coltura . Tuttavia, quando si trattava di organismi non pigmentati e agenti patogeni , gli scienziati – primo tra tutti Robert Koch-  hanno cominciato ad utilizzare estratti di carne bovina in maniera stabile.

Substrati solidi:

Nel 1881 Robert Koch dimostrò per la prima volta una nuova tecnica al Congresso Medico Internazionale di Londra. Koch aveva riconosciuto le difficoltà di utilizzo dei media liquidi per l’isolamento di colture pure, e aveva trovato alternative valide nei terreni solidi . Dopo aver testato e valutato terreni di coltura  come albume d’uovo coagulato, pasta di amido e addirittura una fetta di patata tagliata in modo asettico ( la stessa usata dal biologo Schroeter ), concluse che il miglior terreno era rappresentato da un estratto di carne con aggiunta di gelatina . La risultante “gelatina nutriente” veniva versata su lastre di vetro piane, inoculate e poste sotto una campana di vetro.

Sebbene la “gelatina nutriente” fosse un progresso importante , la gelatina aveva due svantaggi principali come agente gelificante :

  • Si trasformava da Gel a Liquido a 25°C – impedendo alle lastre di essere incubate a temperature più elevate .
  • Veniva  idrolizzata dalla gelitinase – un enzima prodotto dalla maggior parte dei microrganismi proteolitici .

Fu nel 1882 che Fannie Hesse suggerì di sostituire la gelatina con agar. Fannie, moglie di Walther Hesse, stava lavorando nel laboratorio di Koch come tecnico del marito e aveva precedentemente usato agar per preparare gelatine di frutta dopo aver sentito dellle sue proprietà gelificanti da alcuni amici.

L’agar è un polisaccaride derivato da alghe rosse, che ha dimostrato di essere un agente gelificante superiore a qualsiasi altro. L’ Agar ha inoltre notevoli proprietà fisiche : si scioglie quando viene riscaldato a circa 85 ° C , e ancora una volta raffreddato non torna allo stato di gel fino a 34 – 42°C . L’ Agar è anche più chiaro della gelatina e resiste alla digestione da parte degli enzimi batterici . L’uso di agar permette la creazione di un mezzo che può essere inoculato a 40oC allo stato fuso raffreddato e incubato a 60 ° C senza sciogliersi.

julius richard petri inventore delle piastre da laboratorio

Julius.r. Petri, inventore delle note piastre tonde.

Sebbene l’ estratto di carne fosse una fonte preziosa di numerosi fattori di crescita per i batteri mancava ancora di sufficiente azoto amminico o per consentire la crescita ottimale di numerosi microrganismi. Nel 1884 Fredrick Loeffler aggiunse dunque peptone e sale alla formulazione a  base di estratto di carne di Koch. Il peptone veniva a quell’epoca usato come prodotto farmaceutico, di solito prescritto per i disturbi alimentari.

Nel 1887 Julius Richard Petri, un altro tecnico che lavorava nel laboratorio di Koch, modificò la lastra di vetro piana introducendo un nuovo tipo di piastra di coltura, progettata con un coperchio per tenere all’esterno gli agenti inquinanti, quasi invariata nelle caratteristiche funzionali fino ai giorni nostri.
A partire dal 1890 sono dunque stati sviluppati i terreni di coltura che conosciamo oggi , con piastre di Petri , peptoni e agar.

Substrati selettivi:

I terreni di coltura, tuttavia, non erano ancora in grado di essere discriminanti. Il primo passo verso supporti di diagnostica di questo tipo è stato fatto nel 1888 , da Martinus Beijerinck che sviluppò un substrato selettivo per il batterio Rhizobium, in grado di fissare l’azoto atmosferico, progettando un gel privo di composti azotati, limitando la crescita di sole colonie di batteri azoto-fissatori.

Si sono infine susseguite numerose scoperte chiave nell’ambito della selettività dei terreni di coltura:

  1. 1905 : MacConkey usa i sali biliari per selezionare batteri fecali. Il livello di coniugazione nei sali biliari determina il profilo di selettività : sali biliari coniugati sono meno inibitori e permettono la crescita di stafilococchi ed enterococchi , mentre sali più dissociati come desossicolato sono molto più selettivi , consentendo solo la crescita di Enterobacteriacae .
  2. 1912 : Churchman mostra che i derivati ​​di trifenilmetano come il violetto di genziana era inibitorio per i batteri Gram positivi.
  3. 1923 : Muller sviluppa un substrato con iodio e tiosolfato di sodio che reagiscono insieme per formare tetrationato . La selettività del tetrationato dipende dal fatto o meno un organismo possiede l’enzima tetrationasi. Salmonella e Proteus possiedono l’enzima, così possono crescere in presenza di Tetrationato .
  4. alexander fleming nel suo laboratorio

    Alexander Fleming nel suo laboratorio

    1960: Fleming, Florey e Chain sono stati insigniti del premio Nobel nel 1945 per lo sviluppo della penicillina , ma è solo nel 1960 che gli antibiotici sono utilizzati in terreni di coltura come agenti selettivi . Thayer e Martin realizzano una formulazione per l’isolamento di Neisseria gonorrhoeae e N. meningitidis , con una miscela di vancomicina , colistina e trimetoprim, uno dei primi esempi ben documentati di antibiotici utilizzati in un terreno selettivo.

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