Genotipizzazione senza estrazione e purificazione di DNA ?



Lightcycler di Roche diagnostics

Schema di funzionamento del Lightcycler di Roche

I metodi attuali per la PCR (polymerase chain reaction) utilizzano DNA genomico purificato, per lo più isolato da cellule periferiche del sangue o di globuli bianchi (WBC), che può essere migliorata con un metodo basato su fluorescenza in tempo reale grazie ad energia di risonanza,  per una genotipizzazione direttamente a partire dalle cellule sanguigne.

Alcuni Ematologi presso l’ospedale universitario Son Espases (Palma de Mallorca, Spagna) hanno studiato sangue periferico di 34 pazienti raccolti in provette contenenti acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Tra i campioni, hanno incluso una miscela di alleli mutanti per i pazienti affetti da trombosi o emocromatosi ereditaria. I globuli rossi (RBC) sono stati lisati e i globuli bianchi (WBC) isolati. Una PCR in tempo reale è stata infine svolta, seguita da una analisi della curva di fusione di diversi geni tra cui metilentetraidrofolatoreduttasi (MTHFR), emocromatosi (HFE), fattore di coagulazione V Leiden (F5), fattore di protrombina due (F2) e coagulazione fattore XII (F12) .

La PCR in tempo reale è stata eseguita sullo strumento LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics). Al fine di uniformare i campioni per la reazione di PCR in tempo reale, le cellule sono state contate in uno Scepter 2.0 Automated Cell Counter (Merck Millipore) e adeguati con 5 × 106 cellule / ml.

Gli autori hanno concluso che il loro protocollo evita la fase di purificazione del DNA, risparmiando così tempo e risorse. Inoltre, poiché la manipolazione effettuata sul campione è minima, può diminuire il rischio di contaminazione. Come hanno segnalato i risultati di una varietà di geni, essi sostengono che il loro protocollo sarà adatto per la genotipizzazione di quasi ogni polimorfismo ereditato. Lo studio è stato pubblicato il 25 giugno 2014, nel Journal of  Blood Medicine.

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