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Protocollo di Colorazione Argentica o Silver Stain

Il Silver Stain, o colorazione argentica, permette di colorare le proteine separate in un gel di poliacrilammide, un copolimero della acrilammide (CH2=CH-CO-NH2), a fronte di separazione tramite elettroforesi. Le proteine si legano agli ioni di Argento, che possono poi essere ridotti al fine di accumularsi in un’immagine visibile stratificata.  La tecnica, coinvolta principalmente nella preparazione per analisi tramite spettrometria di massa,  è talvolta utilizzata anche per la colorazione di porzioni di  DNA. Per la colorazione delle proteine questo protocollo ha livelli di sensibilità maggiori ed un costo minore rispetto al Blue Coomassie ma non fornisce risultati quantitativi.

 

SOLUZIONI DA PREPARARE

  • protocollo di colorazione argentica o silver stainFIXING SOLUTION: 40% etanolo; 10% acido acetico.
  • WASHING SOLUTION I: 30% etanolo.
  • WASHING SOLUTION II: 20% etanolo.
  • SENSITIZER SOLUTION: 0,02% Na2S2O3
  • SILVER STAIN: 0,2% AgNO3 –fotosensibile– (Aggiungere 0,02% di Formaldeide prima dell’uso).
  • SOLUZIONE DI SVILUPPO: 3% Na2CO3 (Aggiungere 0,05% di Formaldeide prima dell’uso).
  • BLOCKING SOLUTION: 0,5% Glicina.

METODICA

  1. Incubare il gel nella Fixing solution per almeno 3h
  2. Lavare per 20 minuti nella Washing Solution I
  3. Lavare per 20 minuti nella Washing Solution II
  4. Lavare  per 20 minuti in H2Omq
  5. Incubare il gel 1’ nella Sensitizer solution
  6. Lavare  per 20 secondi in H2Omq (x3)
  7. Colorare  per 20 minuti con il Silver Stain
  8. Lavare per 20 secondi in H2Omq (x3)
  9. Incubare per  3-5 minuti nella Soluzione di Sviluppo
  10. Lavare per 20 secondi con H2Odemi
  11. Incubare per 5 minuti nella Blocking Solution
  12. Lavare per 10 minuti  in H2Odemi (x3)