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Protocollo di Estrazione di proteine di membrana da coltura cellulare eucariotica

 

Questo protocollo rappresenta uno step iniziale di estrazione proteica da colture cellulari eucariotiche, sia per colture aderenti che per colture di cellule in sospensione. Questa procedura non produce estrazione di proteine subcellulari o da cytosol, per le quali è necessaria una procedura di lisi di membrana, ma rappresenta la soluzione più rapida nell’ambito di procedure di immunofissazione o immunoblot. La metodica presuppone la preparazione o la disponibilità di inibitori delle proteasi che difendano il campione da degradazione enzimatica. Questa tecnica tradizionale è facilmente sostituibile con numerosi kit “usa e getta” disponibili dai maggiori fornitori di reagenti.

 

 

SOLUZIONI DA PREPARARE

 

 

inibitori delle proteasi per 10ml  da aggiungere a PBS o TBS:

protocollo di estrazione proteine da colture

  • 100 µl di PMSF 50 mM
  • 20 µl di EDTA 500 mM
  • 100 µl di Leupeptina 1 mg/ml
  • 50 µl di Pepstatina A 2 mg/ml
  • 20 µl di Aprotinina 1mg/ml
  • 20 µl di Antipaina 1 mg/ml
  • 10 µl di Benzamidina 1 mg/ml
  • 20 µl di Chimostatina 1 mg/ml
  • 50 µl di NaVO3 200 mM
  • 50 µl di NaF 200 mM

 

METODICA

Per colture cellulari aderenti:

  1. Ricordarsi di lavorare sempre in ghiaccio
  2. Lavare le piastre 2 volte con PBS o DPBS (Phosphate Buffered Saline) senza Ca++ e Mg++
  3. Aggiungere 500 µl di inibitore delle proteasi precedentemente preparato, per piastre da 10 cm, e rimuovere le cellule tramite uno scraper.
  4. Raccolta del liquido in una provetta.

Per cellule libere in sospensione:

  1. Precipitare le cellule in sospensione tramite centrifuga per 15 minuti a 3200 rpm.
  2. Sciaquare il pellet con PBS o TBS e centrifugare nuovamente.
  3. Sospendere nuovamente il pellet in 500 µl di inibitori delle proteasi.

Per entrambi i casi segue:

  • Centrifuga per 5 minuti a 3000 rpm a 4˚C
  • Sospendere nuovamente il pellet in 40 µl di inibitori delle proteasi + 1% Igepal
  • Far riposare in ghiaccio per 15 minuti.
  • Centrifuga per 15 minuti  a 12000 rmp a 4˚C.
  • Pipettare la fase liquida con le proteine in altro contenitore.