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Protocollo e metodica di conteggio degli eritrociti fetali

 Materiali necessari:

 

  • Campioni di sangue intero opportunamente anticoagulato con EDTA or altro anticoagulante (da testare entro 4 ore dal prelievo o preservare per meno di 72 ore a 4°c)
  • Fetaltrol stabilizzato a 3 livelli di controllo (Trillium diagnostic, distribuito da Beckman Coulter) o altri campioni di controllo.
  • PBS 0.1% oppure BSA
  • 0.05% glutaraldeide
  • 0.1%  di Triton X-100
  • Soluzione di anticorpi Anti-HbF
  • 1% formaldeide fissativa
  • provette usa e getta in polistirene 12 × 75–mm con rack
  • Centrifuga per cell-washing (es DAC II baxter o equivalente)
  • Citofluorimetro multi-parametro con 488-nm di eccitazione e filtri per fluorescenza verde ed arancione
  • Software del tipo WinList o integrato nel citofluorimetro.

 

  1. conta conteggio eritrociti fetaliAnalisi di campione di FETALtrol  con 1,5% di cellule fetali colorate con anti-HbF. I File listmode sono raccolti con parametri di dispersione della luce, fluorescenza verde (anti-HbF segnale FITC), e fluorescenza arancione  (segnale di autofluorescenza). L’Analisi viene eseguita in modo da escludere piccole particelle e cellule nucleate autofluorescenti come indicato nella regione R1 del pannello A con i gating  R1 visualizzati come un singolo istogramma di fluorescenza della distribuzione HbF, come mostrato nel pannello B. La distribuzione di HbF negli eritrociti mostra tipicamente tre regioni di eritrociti adulti privi di contenuto HbF (R2), cellule F adulte con un livello intermedio di HbF (R3), e globuli rossi fetali (se presenti) con alti livelli di HbF (R4), come mostrato nel pannello B.

 

  1. metodica conta emazie fetaliIstogrammi rappresentativi di una configurazione ottimale del protocollo per l’analisi dei globuli rossi fetali nel campione di sangue colorato con anticorpi monoclonali anti-HbF. Il posizionamento della popolazione “negativa” di eritrociti privi di HbF dovrebbe essere entro la prima decina sia  per l’anti-HbF che per l’ autofluorescenza, e la popolazione leucocitaria con elevato livello di autofluorescenza deve essere tipicamente posizionata su una diagonale a 45 °. Il pannello A mostra il tipico light-scatter dei globuli rossi. Il pannello B mostra il livello più elevato di autofluorescenza mostrato da leucociti (e altre cellule nucleate) racchiusi in R1 ed emazie prive autofluorescenza significativa (grande cluster), che è la popolazione racchiusa in R2 per eventuali analisi di cellule fetali. Il pannello C dimostra la configurazione ottimale dello strumento in modo che i due segnali fluorescenti abbiano intensità equilibrata ed uguale sia per i leucociti autofluorescenti o sia per le cellule nucleate (R3).