PROTOCOLLO DI ARRICCHIMENTO DI MONOCITI IN CELLULE MONONUCLEATE DEL SANGUE PERIFERICO

cellule mononucleate del sangue periferico

Cellule mononucleate del sangue periferico

Questo protocollo è utilizzato tipicamente per ridurre il costo del cell-sorting con i reagenti MACS. la sospensione ottenuta alla fine di questo protocollo contiene 40-70% di monociti, e può essere utilizzata per separazione MACS positiva o negativa.

I buffy-coat da utilizzare per questo protocollo devono essere freschi e prodotti senza perdita di piastrine. Il volume di buffy-coat da utilizzare è di solito di circa 75ml

 METODICA

Nota: La  PBS utilizzata deve essere priva di  Ca2+ e Mg2+

  1. Diluite il buffy-coat fino a 150 ml con la PBS.
  2. Preparate 2 gradienti Ficoll  in provette Leucosep (15 ml di Ficoll per provetta).
  3. Aggiungere 30 ml di sangue diluito ad ogni gradiente.
  4. Centrifugare 30 min a 400 x g senza pause.
  5. Raccogliere la frazione di mononucleati (PBMC) e trasferire in provetta da 50 ml.
  6. Riempire la provetta con la PBS, centrifugare 10 min a 300 x g.
  7. Sospendere nuovamente in 50 ml PBS, centrifugare 10 min a 200 x g.
  8. Sospendere nuovamente in 50 ml PBS, centrifugare 10 min a 300 x g.
  9. Preparare un gradiente Percoll continuo.
  10. Applicare tutte le cellule sul gradiente Percoll.
  11. Centrifugare 30 min a 400 x g senza pause.
  12. Raccogliere il PBMC arricchito e trasferire in provetta da 50 ml.
  13. Riempire la provetta con PBS e centrifugare 10 min a 300 x g.
  14. Risospendere in 50 ml di PBS, centrifugare 10 min a 200 x g (2 volte)
  15. Determinare il numero di cellule, prendere un campione per analisi FACS e procedere con separazione MACS.