Arricchimento dei Monociti in cellule mononucleate pbmc

Arricchimento dei Monociti in cellule mononucleate pbmc

PROTOCOLLO DI ARRICCHIMENTO DI MONOCITI IN CELLULE MONONUCLEATE DEL SANGUE PERIFERICO

cellule mononucleate del sangue periferico

Cellule mononucleate del sangue periferico

Questo protocollo è utilizzato tipicamente per ridurre il costo del cell-sorting con i reagenti MACS. la sospensione ottenuta alla fine di questo protocollo contiene 40-70% di monociti, e può essere utilizzata per separazione MACS positiva o negativa.

I buffy-coat da utilizzare per questo protocollo devono essere freschi e prodotti senza perdita di piastrine. Il volume di buffy-coat da utilizzare è di solito di circa 75ml

 METODICA

Nota: La  PBS utilizzata deve essere priva di  Ca2+ e Mg2+

  1. Diluite il buffy-coat fino a 150 ml con la PBS.
  2. Preparate 2 gradienti Ficoll  in provette Leucosep (15 ml di Ficoll per provetta).
  3. Aggiungere 30 ml di sangue diluito ad ogni gradiente.
  4. Centrifugare 30 min a 400 x g senza pause.
  5. Raccogliere la frazione di mononucleati (PBMC) e trasferire in provetta da 50 ml.
  6. Riempire la provetta con la PBS, centrifugare 10 min a 300 x g.
  7. Sospendere nuovamente in 50 ml PBS, centrifugare 10 min a 200 x g.
  8. Sospendere nuovamente in 50 ml PBS, centrifugare 10 min a 300 x g.
  9. Preparare un gradiente Percoll continuo.
  10. Applicare tutte le cellule sul gradiente Percoll.
  11. Centrifugare 30 min a 400 x g senza pause.
  12. Raccogliere il PBMC arricchito e trasferire in provetta da 50 ml.
  13. Riempire la provetta con PBS e centrifugare 10 min a 300 x g.
  14. Risospendere in 50 ml di PBS, centrifugare 10 min a 200 x g (2 volte)
  15. Determinare il numero di cellule, prendere un campione per analisi FACS e procedere con separazione MACS.