Protocollo di preparazione ed isolamento di piastrine

Per evitare l’attivazione delle piastrine è necessario che tutta la procedura sia svolta il più rapidamente possibile ed in modo accurato, possibilmente lavorando su ghiaccio. Questo protocollo si basa su centrifugazione differenziale per separare le piastrine dalle cellule ematiche, in alternativa la metodo di Robinson.

1. 

   stratificazione del campione di sangue a seguito di centrifuga con anticoagulante

   Prelevare il campione di sangue attraverso il plesso retroorbitale o vena della coda, sotto anestesia.

2. Raccogliere il sangue in tubi eppendorf con ACD (destrosio-acido-citrato, Sigma C-3821) in rapporto in volume di 1 a 3 (1 volume di ACD, 3 volumi di sangue + 6.6 volumi di PBS
3. Centrifugare a 216-220g per 5-6 minuti a 10°C
4. prelevare PRP e stoccare a 4°C
5. Aggiungere 1ml di PBS o BSGC ai rimanenti eritrociti + altre cellule
6. Ripetere gli ultimi 3 punti 3 volte
7. Unire i campioni di prp prelevati
8. Centrifugare a 1613g per 10 minuti, a 10°C
9. Prelevare il surnatante (SN)
10. Sospendere nuovamente le piastrine sedimentate in EDTA o BSGC
11. Centrifugare a 216-220g per 5-6 minuti a 10°C
12. Sospendere nuovamente in EDTA o BSGC. Effettuare conta
13. Trasferire il surnatante in un’altra provetta, e stoccare a 4°C