Spettrometria e MALDI, consigli sulla preparazione del campione

Le tecniche di Imaging tramite spettrometria di massa (IMS) producono una rappresentazione visiva spaziale della composizione molecolare di un campione biologico. I progressi nella strumentazione e potenza di calcolo, così come nell’esperienza sperimentale, consentono di mappare centinaia di proteine, carboidrati, lipidi, piccole molecole e virtualmente ogni altra molecola compatibile con questa tecnologia, senza l’uso di specifici reagenti mirati.

I ricercatori hanno ideato decine di strategiedi  IMS, comprese le varianti che non richiedono preparazione del campione e che funzionano sia a pressione atmosferica che con campione sotto vuoto. Un approccio popolare è il matrix-assisted laser  (MALDI)-IMS, sviluppato nel 1997 da Richard Caprioli,  Direttore del Centro di Ricerca di Spettrometria di Massa presso la Vanderbilt University School of Medicine, e il suo team.

Ecco alcuni suggerimenti su come ottenere un campione preparato e pronto per l’imaging, sulla base dei consigli dello stesso Caprioli in materia:

Il MALDI-IMS si basa su una miscela ionizzabile di matrice e di campione che viene prelevato e analizzato mediante spettrometria di massa, un punto alla volta, per creare una serie di immagini 2D che rappresentanola distribuzione molecolare del campione, idealmente un puntino per ogni molecola.

Idealmente, il tessuto da acquisire è perfettamente disposto su un vetrino o matrice di tessuto. In realtà, molte variabili possono influenzare questa fase, a cominciare dal modo in cui il campione viene inizialmente acquisito e conservato. Se è possibile, comunicare con il personale che si occupa della raccolta e la preparazione dei campioni. E ‘meglio immediatamente congelare il campione dopo averlo posato galleggiante su un criogeno (come azoto liquido) per poi avvolgerlo nella pellicola immergendolo nel bagno criogeno; questo aiuta a preservare sia l’integrità molecolare che quella istologica.

Può anche essere utilizzato un tessuto fissato chimicamente, e  la maggior parte dei tessuti è conservato in questo modo, e sono stati sviluppati molti protocolli specifici per questo scopo. Ma bisogna essere consapevoli che la reticolazione che si verifica durante il processo di ostacolerà l’analisi delle proteine tramite MS.

I mezzi utilizzati per incorporare il campione possono anch’eessi avere un effetto. Le soluzioni polimeriche, come il popolare “Optimal Cutting temperature” (OCT) (ad esempio, Fisherbrand ™ HistoPrep ™ ) possono causare contaminazione e soppressione ionica. Quindi, invece di incorporare il campione congelato in OCT, usarlo solo come collante per fissare il campione al mandrino del criostato. Se incorporare il campione è inevitabile, lavare il campione con etanolo prima di applicare matrice MALDI.

 Tipicamente una soluzione di acido organico (più comunemente acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB), α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA) o acido 3,5-dimetossi-4-idrossicinnamico (SA, acido sinapinic)) in un solvente organico (ad esempio, metanolo, etanolo o acetonitrile), con 0,1% di acido trifluoroacetico, viene applicato al campione, dove si estrae e co-cristallizza con gli analiti. La matrice cattura l’energia laser e lo trasferisce gli analiti, permettendo a quest’ultimo di desorbire e ionizzare, e successivamente inserire l’analizzatore MS.

Il protocollo di base IMS è stato sviluppato per le proteine ​​idrofile e peptidi e piccole molecole, metaboliti e lipidi. Se si desidera osservare un idrofobo, transmembrana o proteine ​​insolubili, sarà necessario trattare il campione con una soluzione compatibile con MALDI.