Nuova tecnologia CRISPR per modificare l’RNA, compresi gli RNA Virus come il coronavirus

Nuova tecnologia CRISPR per modificare l’RNA, compresi gli RNA Virus come il coronavirus

16/03/2020 Off By LabIta

Gli screening genetici basati sul CRISPR hanno aiutato gli scienziati a identificare i geni che sono attori chiave nell’anemia falciforme, nell’immunoterapia del cancro, nelle metastasi del cancro del polmone e in molte altre malattie. Tuttavia, questi screening genetici hanno una portata limitata: possono solo modificare o indirizzare il DNA. Per molte regioni del genoma umano, il targeting per DNA potrebbe non essere efficace e altri organismi, come i virus RNA come il coronavirus o l’influenza, non possono essere presi di mira con gli schermi CRISPR per il targeting del DNA esistenti.

Ora, in un’importante nuova risorsa per la comunità scientifica pubblicata oggi su Nature Biotechnology, i ricercatori del laboratorio di Neville Sanjana, Ph.D., presso il New York Genome Center e la New York University hanno sviluppato un nuovo tipo di tecnologia CRISPR per RNA target.

I ricercatori hanno capitalizzato un enzima CRISPR recentemente caratterizzato chiamato Cas13 che prende di mira l’RNA anziché il DNA. Usando Cas13, hanno progettato una piattaforma ottimizzata per schermi genetici fortemente paralleli a livello di RNA nelle cellule umane. Questa tecnologia di screening può essere utilizzata per comprendere molti aspetti della regolazione dell’RNA e per identificare la funzione degli RNA non codificanti, che sono molecole di RNA che vengono prodotte ma non codificano per le proteine.

coronavirus crisprMirando a migliaia di siti diversi nelle trascrizioni di RNA umano, i ricercatori hanno sviluppato un modello predittivo basato sull’apprendimento automatico per accelerare l’identificazione degli RNA guida Cas13 più efficaci. La nuova tecnologia è disponibile per i ricercatori attraverso un sito Web interattivo e una cassetta degli attrezzi open source per prevedere l’efficienza dell’RNA guida per target RNA personalizzati e fornisce RNA guida pre-progettati per tutti i geni di codifica delle proteine ​​umane.

“Prevediamo che gli enzimi Cas13 rivolti all’RNA avranno un grande impatto sulla biologia molecolare e sulle applicazioni mediche, ma si sa poco sulla progettazione dell’RNA guida per un’elevata efficacia di targeting”, ha affermato il dott. Sanjana, autore senior dello studio. “Abbiamo deciso di cambiarlo attraverso uno studio approfondito e sistematico per sviluppare principi chiave e modelli predittivi per la progettazione di guide più efficaci.”

Il dott. Sanjana è un membro della facoltà principale del New York Genome Center, un assistente professore di biologia alla New York University e un assistente professore di neuroscienze e fisiologia presso la NYU School of Medicine.

Gli enzimi Cas13 sono enzimi CRISPR di tipo VI (ripetizioni palindromiche brevi intervallate regolarmente) che sono stati recentemente identificati come proteine ​​programmabili guidate da RNA, mirate all’RNA con attività nucleasica che consente il knockdown del gene bersaglio senza alterare il genoma. Questa proprietà rende Cas13 una terapia potenzialmente significativa per influenzare l’espressione genica senza alterare in modo permanente la sequenza genomica.

“Questo è il tipo di innovazione tecnologica che promuoviamo e sviluppiamo presso il New York Genome Center. Questa ultima tecnologia CRISPR del Sanjana Lab ha implicazioni entusiasmanti per far avanzare i campi della genomica e della medicina di precisione”, ha affermato Tom Maniatis, Ph.D. , Direttore scientifico e amministratore delegato della famiglia Evnin, New York Genome Center.

Scienziato post dottorato Hans-Hermann Wessels e Ph.D. lo studente Alejandro Méndez-Mancilla, co-primo autore dello studio, ha sviluppato una suite di nuovi strumenti basati su Cas13 e condotto uno schermo di piastrellatura e permutazione della trascrizione in cellule di mammiferi. In totale, i ricercatori hanno raccolto informazioni per oltre 24.000 guide di targeting per RNA.

“Abbiamo affiancato gli RNA attraverso molte trascrizioni diverse, tra cui diversi geni umani in cui potremmo facilmente misurare il knock-down della trascrizione mediante colorazione di anticorpi e citometria a flusso”, ha affermato il dott. Wessels. “Lungo la strada, abbiamo scoperto alcune interessanti intuizioni biologiche che potrebbero espandere l’applicazione degli enzimi Cas13 mirati all’RNA.”

Tra i risultati del team, ad esempio, vi sono approfondimenti su quali regioni dell’RNA guida sono più importanti per il riconoscimento di un RNA target. Utilizzando migliaia di RNA guida con 1, 2 o 3 disallineamenti a lettera singola per il loro RNA target, hanno identificato una regione critica “seed” che è squisitamente sensibile alle discrepanze tra la guida CRISPR e il target. Questa scoperta aiuterà gli scienziati a progettare RNA guida per evitare attività off-target su RNA target non intenzionali. Poiché una tipica cellula umana esprime circa 100.000 RNA, il targeting accurato di Cas13 del solo target previsto è vitale per lo screening e le applicazioni terapeutiche.

Oltre a migliorare la nostra comprensione degli off-target di Cas13, la regione “seed” potrebbe essere utilizzata per i biosensori di prossima generazione che possono discriminare più precisamente tra specie di RNA strettamente correlate. In totale, questo studio aumenta il numero di punti dati di precedenti studi Cas13 nelle cellule di mammiferi di oltre due ordini di grandezza.

“Siamo particolarmente entusiasti di utilizzare il sistema di screening Cas13 ottimizzato per colpire gli RNA non codificanti”, ha dichiarato il collega co-primo autore Méndez-Mancilla. “Questo amplia notevolmente la cassetta degli attrezzi CRISPR per gli schermi genetici e trascrittomici avanzati”. Nello studio, i ricercatori hanno notato una marcata differenza nel knockdown proteico quando prendevano di mira diversi elementi codificanti e non codificanti delle proteine degli RNA messaggeri, e hanno trovato prove che Cas13 compete con altre proteine leganti l’RNA coinvolte nell’elaborazione e nello splicing delle trascrizioni.

Il team ha recentemente sfruttato il suo modello predittivo di guida RNA per un’analisi particolarmente critica: l’emergenza di sanità pubblica COVID-19 è dovuta a un coronavirus, che contiene un genoma dell’RNA, non del DNA. Utilizzando il modello derivato dai loro schermi massicciamente paralleli, i ricercatori hanno identificato gli RNA guida ottimali che potrebbero essere utilizzati per applicazioni di rilevamento e terapeutiche future.