Protocollo di trattamento con DNAse

Il cell-clumping delle cellule può causare scarsa purezza quando le cellule target sono aggregate a cellule non target. Questo può tipicamente avvenire quando vi è un rilascio di DNA da parte di cellule lise in soluzione, da rimuovere opportunamente con questa metodica.

SOLUZIONI DA PREPARARE

• 

  una molecola di DNAse 1

  DNAse ( Sigma D – 4513 ) 100 mg / ml in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS , Sigma H- 6648)

• Cloruro di magnesio esaidrato ( Sigma M – 2670 ) MW = 203.3
• 203 mg / ml = 1000 mm o 200X

METODICA

1. Trattare le cellule da 15 a 30 minuti in una soluzione di 100 mg / mL DNAsi e 5 mM MgCl2 in HBSS a temperatura ambiente .
2. Lavare le cellule una volta con 5 mM MgCl2 in HBSS .
3. Filtrare con un Falcon ® Strainer cellulare ( Catalogo # [ 35 ] 2340 o # [ 35 ] 2235 ) .
4. Sospende delicatamente il BSA contenente MgCl2 e 25-50 mg / mL DNAse ( come mantenimento ), prima e durante l’ordinamento .

NOTE

Il DNAse richiede una concentrazione di almeno 1 mM di magnesio per lavorare in modo efficace , anche se 5 mM è la quantità ottimale. È inoltre importante ridurre al minimo la presenza di cellule morte durante questa procedura , poiché l’actina rilasciato dalle cellule morte inibisce irreversibilmente DNAsi I.